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上海欧易生物医学科技有限公司

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Sequel三代基因组测序
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PacBio三代测序技术简介

SMRT测序的全称是Single Molecule, Real-Time Sequencing,即单分子实时测序,是PacBio推出的一项专利技术。顾名思义,SMRT技术核心就是能够实现单个DNA分子的测序,并且实时监控测序结果。

 SMRT Cell

SMRT Cell是PacBio测序中用于DNA上样的芯片,样本完成建库后装载到Cell中才能进行上机测序。其概念可类比二代测序中经常提到的“Lane”。一次运行中(即一个Run),我们按照实验需求选择1 ~ 16个Cell进行测序。PacBio RS II系统配套的SMRT Cell数据产量为500 M ~ 1 G(每个SMRT Cell),最新升级的Sequel系统配套的SMRT Cell可产生5 ~ 10 G的数据(每个SMRT Cell),通量大大提升。



  ZMW

ZMW孔全称是Zero-Mode Waveguides,通常翻译为零模波导孔。Sequel测序仪的测序工作是以SMRT Cell为单位进行的,而每一个SMRT Cell中都含有大量这种圆形纳米小孔,直径为50 ~ 100 nm。该小孔利用了一种物理效应——零模波导,外径比激发光波长小,当DNA分子进入小孔后,因激发光从孔底发出的光不能穿透小孔进入上方的溶液区,仅被限制在底部一个足以覆盖被检测DNA部分的区域,进而收集该区域的信号,将背景噪音降到最低。PacBio RS II使用的SMRT Cell中,每个含有15万个ZMW孔,而最新的Sequel平台配套的升级版SMRT Cell中,每个含有100万个ZMW孔,进而通量提升7倍。


零膜波导孔示意图

 SMRT测序原理

PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想,并以SMRT芯片为测序载体。SMRT测序采用四色荧光标记的dNTP和ZMW孔完成对单个DNA分子的测序:当DNA模版被DNA聚合酶捕获后,4种不同荧光标记的dNTP通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合,与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间。因此统计荧光信号存在时间的长短,可区分匹配的碱基与游离碱基。

4色荧光标记4种碱基(即dNTP),在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。每个ZMW孔中,单个DNA分子模板与引物结合,然后与DNA聚合酶结合,被固定到ZMW孔底部。加入四色荧光标记的dNTP后,DNA合成开始。受碱基配对原则支配,连接上的dNTP会在ZMW孔底部停留较长时间,激发后所发出的对应荧光信号被识别,返回的荧光信号会形成一个特殊的脉冲波。另一方面由于荧光信号连接在dNTP的磷酸基团上,当上一个dNTP合成后,磷酸基团自动脱落,保证了检测的连续性,提高了检测速度,并配合高分辨率的光学检测系统以实现实时检测。


SMRT测序原理

SMRT测序中使用的这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。另一个关键是荧光基团标记在核苷酸3’端磷酸上。在DNA合成过程中,3’端的磷酸键随着DNA链的延伸被断开,标记物被弃去,减少了DNA合成的空间位阻,维持DNA链连续合成,延长了测序读长。而第二代测序技术中荧光基团都标记在5’端甲基上,在合成过程中,荧光标记物保留在DNA链上,随DNA链的延伸会产生三维空间阻力,导致DNA链延长到一定程度后出现错读,这是限制二代测序读长的原因之一。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性,是最接近天然状态的聚合酶反应体系。

PacBio SMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW(零模波导孔)原理:如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔,小孔直径有考究,如果直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来,从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围,而是保持直线状态(光衍射的原理),从而可起保护作用。同理,在一个反应管(SMRT Cell,单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,即ZMW,外径100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围内(体积20×10-21L),正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景降到最低。另外,可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间,来检测一些碱基修饰情况,既如果碱基存在修饰,则通过聚合酶时的速度会减慢,相邻两峰之间的距离增大,可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快,每秒约10个dNTP。三代测序同样存在测序错误,但好在它的出错是随机的,并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向,因而可以通过多次测序来进行有效的纠错,其原理参见SMRT建库。目前Sequel系统已能达到相当于Q50以上质量的测序准确度。

 SMRT建库

1)文库制备

材料:全基因组DNA,或者cDNA,或者目标扩增产物;

片段化:全基因组太大,仍然需要片段化,但因为测序读长很长,所以可以做成很大的片段文库;

连接:先把片段粘末端变成平端,两端分别连接环状单链:单链两端分别与双链正负链连接上,得到一个类似哑铃(“套马环”)的结构,称为SMRT Bell。连接半小时内完成。


2)引物退火&聚合酶结合

当引物与模板的单链环部位退火后,这个双链部位就可以结合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。

3)测序策略

万事俱备,一旦向反应中加入正常的离子,DNA聚合反应开始了。模板双链打开成环形,先合成正链,单链区,跟着合成负链。聚合酶每合成一圈,对于定向目标序列,就相当于2×覆盖度。由于合成产物和天然产物一致,聚合酶可以持续合成很长很长的产物,亦即循环合成很多圈(重复多次),对于定向单分子目标序列来说就可以得到很高的覆盖度,即获得很多Subread,这就意味着可以对非常低的频率的片段获得很高的准确度,这称为环形一致序列(Circle Consensus Sequence,CCS)模式,该模式适用于稀有突变及需要高精确度的测序。这也是单分子测序能比NGS灵敏度更高地,高准确度地检测到稀有突变的原理。


  SMRT技术优势

  • 单分子测序:可将某些复杂结构的DNA分子解开,进行精确的检测;
  • 测序读长:平均测序读长达到10 ~ 18 kb,最长可超过60 kb;
  • 准确度高:测序深度达到30×时,准确度达到99.999%(Q50);
  • 敏感性强:可以检测频率在0.1%的Minor Variants;
  • PCR扩增偏好性:样本不需要进行PCR扩增,避免了覆盖度不均一以及PCR Artifacts的产生;
  • 最小的GC偏好性(GC bias):在极端高GC和极端低GC区域,可以轻松测定,从而保证序列的均匀覆盖度;
  • 可直接检测碱基修饰:利用测序过程聚合酶反应的动力学变化,首次实现在测序的同时对碱基修饰进行直接检测。


SMRT测序应用

1)全长转录本测序

PacBio Sequel的长读长可实现全长转录本测序,并使基因可变剪接形式的识别成为可能,因此可以对新基因及其Iso-form进行更全面的研究。同时,长读长不再需要对RNA-Seq的Reads进行组装,因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释,用以改进参考基因组中的基因注释信息。

2微生物&病毒复杂动态群体分析

细菌、病毒甚至癌细胞通畅存在于与变异密切相关的复杂群体中。这些变异会响应环境变化,例如免疫压力或药物治疗造成的快速进化。使用二代测序对复杂群体进行鉴定需要复杂的组装算法,使得混合群体中相关度非常高的个体的区分变得非常困难。Sequel系统可从病毒种群的鉴定、微生物群落的鉴定和体细胞变异的检测三个方面对复杂种群进行鉴定。

3)环境微生物测序

宏基因组测序:长读长Reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定,能够更加快捷地获得更多微生物物种的全基因组序列。

16S rDNA全长测序:16S rDNA长度大约为1 540 bp,PacBio Sequel的平均读长远大于这个长度,因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列。

4)表观遗传学检测

PacBio Sequel利用测序过程聚合酶反应的动力学变化,首次实现在测序的同时对碱基修饰进行直接测序。当碱基有额外修饰时,DNA聚合酶的合成速度会减慢,对应的信号会被检测出来。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”产生微小差异,最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。除了甲基化修饰,还可以检测5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基修饰,甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰。

5)全基因组de novo测序

与二代测序最高不超过1 Kb的读长相比,PacBio Sequel的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。同时,与二代测序的模板样品需要扩增相比,PacBio Sequel无需扩增可直接对单个分子进行测序,有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性,PacBio Sequel可轻松跨越GC含量异常(过高或过低)及高度序列重复的区域,实现序列覆盖的完整性和均一性。

6)基因组草图的优化或基因组完成图绘制

对前期已开展测序的动植物、微生物等基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。针对前期已经开展全基因组测序,获得基因组草图的动植物、微生物等,可以结合PacBio Sequel平台长读长Reads进行补充,从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度。另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息、串联重复序列信息、易位信息等。尤其在微生物基因组完成图的绘制中,可在一天之内将基因组完善获得无间隔的Contigs。

7)全基因组重测序&稀有变异鉴定

PacBio Sequel长读长测序Reads无GC偏好,能够全面获得基因组的遗传变异,包括SNPs的鉴定到CNV、SV结构变异等。PacBio Sequel平台10小时即可完成测序,可应用至需要快速反馈的临床检测中,如细菌感染疾病中细菌的鉴定、病毒的鉴定等,取样开展重测序,和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可。

8)细胞器基因组测序

叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构,PacBio Sequel的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全基因组序列信息等,基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的SNPs及InDel信息。


 Sequel System特点与优势

测序通量增加7

Sequel系统在SMRT Cell的性能方面进行了升级,将一个Cell的密度由原来的15万个ZMW孔增加到100万个,换言之,一个SMRT Cell的数据产出提高了约7倍,而且在该系统推出之初平均读长就已经达到8 ~ 12 kb,使得测序达到更高通量。随着不断的技术改良,一个SMRT Cell的容量还将继续提升至400 ~ 800万个ZMW孔,甚至更多。

测序成本显著降低

Sequel测序系统缩减了光学系统,将仪器机身大小改良为原来的1/3,相对于Illumina Hiseq的体积也小11%。但是增大了SMRT Cell运作空间。根据官方给出的数据,一台Sequel售价35万美元,为RS II仪器售价的一半,而在测序通量上7倍的提升更是进一步降低了测序的成本,采用目前的P6-C4试剂,平均每个SMRT Cell可产生5 ~ 10 Gb的数据,每个Gb的数据产出成本显著降低。因此新型的Sequel测序系统非常适合进行大规模的研究,结合欧易生物位于上海漕河泾高科技园区的测序中心,将为广大研究人员提供更多的便利。

项目周期更短

Sequel测序系统每次运行都可装载1 ~ 16个SMRT Cell,样本制备仅需6小时,测序时间则为0.5 ~ 6小时,从样本制备到测序仅需1天时间就可以完成,并且可以根据实验设计具体要求进行调整。例如3G的人类基因组,进行50×测序,利用RS II需要约150个Cell,大概要运行10轮,而现在则仅需约15个Cell运行1 ~ 2轮可以完成,极大缩短了工作周期。

配套的数据分析

与RS II系统相同,Sequel测序系统同样含有一个触摸屏用于操作和实时监测系统运行信息。配套了全新的SMRT Link软件界面,完善了一系列程序用于样本设置到数据管理整个过程的操作。

SequelRS II系统比较


Sequel

RS II

平均Read长度

10 ~ 18 kb

10 ~ 15 kb

零膜波导孔数量

100万

15万

数据量/SMRT Cell

5 ~ 10 Gb

500 Mb ~ 1 Gb

每次可运行的SMRT Cell

~ 16

1 ~ 16

每个SMRT Cell的运行时间

0.5 ~ 6 hrs

0.5 ~ 6 hrs


服务优势

  • 专业的技术操作人员:具有十二年建库技术沉淀,具有丰富的样本处理和测序实验操作经验;
  • 强硬的硬件支撑:已取得PacBio仪器运行环境、CLIA实验室、5S实验规范管理及ISO9001质量体系认证,拥有多套计算集群,保证数据产出质量和分析速度;
  • 全面的分析内容:具有专业、成熟的生物信息分析团队,熟悉各种分析算法和软件,保证标准、个性化和售后调整分析的全面支撑,并在分析过程中与客户充分互动;
  • 更高的服务标准:采取严格的质量标准、多重实验质控和完备的实验记录,确保更高的成功率、更低的样品损失及实验失败风险,并且客户可以参与整个测序的实验和分析过程,接受客户监督,更加透明和可信;
  • 严谨的科学作风:尊重科学、尊重事实、务求严谨、不弄虚作假;
  • 优秀的服务理念:核心团队平均12年以上技术服务领域工作经验,均具备良好职业操守及客户服务理念。


样品要求

样品采集与处理

(1)    样品类型:细胞、新鲜组织或DNA样品。

(2)    Pacific Biosciences的模板制备过程不使用扩增技术。因此,输入DNA的质量将直接反映在测序结果中。存在于输入材料中的任何DNA损伤(如无碱基位点、缺口、链间交联)或污染物(如单链DNA、RNA、蛋白质、染料或盐)都会损害测序系统的性能。

所以,请确保您的DNA样品符合以下要求:

  • 请提供双链DNA,ssDNA无法产生SMRTbell;
  • 不含不溶物且无RNA污染;
  • 不含原始生物或组织的残留污染物(如血红素、腐殖酸、多酚等);
  • 不含螯合剂(如EDTA),二价金属阳离子(如Mg 2+),变性剂(如胍盐、苯酚)或洗涤剂(如SDS、Triton-X100、CTAB);
  • 没有经历多次冻融循环;
  • 未暴露于高温(高于65℃超过1小时)或极端pH(<6或>9)条件下;
  • 未嵌入荧光染料、未暴露于紫外线;
  • 基因组DNA无明显降解,主带清晰,OD260/280值应在1.8 ~ 2.0之间,OD260/230值约为2.0,无明显弥散。

(3)    样品保存:血液样本、细胞样品或新鲜组织可液氮冻存后,- 80保存;DNA样品可溶于TE(pH=8.0)或超纯水中,- 80保存,保存期间避免反复冻融。

(4)    样品置于1.5 mL进口冻存管中,封口膜封好。

(5)    根据建库时采用的不同片段长度,DNA量的需求如下(仅列出常见类型):

Insert Size

Target

Insert Size

Range

Sheared and Concentrated

DNA Amount

DNA concentration

for End-Repair

500 bp

~ 300 bp to 750 bp

250 ng

15 ng/μL

1 kb

~ 750 bp to 1500 bp

500 ng

30 ng/μL

2 kb

~ 1500 bp to 3 kb

500 ng to 750 ng

25 ng/μL

5 kb

~ 4 kb to 6 kb

2 μg

60 ng/μL

10 kb (low input)

8 kb to 12 kb

1 to 5 μg

30 ng/μL

10 kb

8 kb to 12 kb

5 μg

140 ng/μL

10 kb to 20 kb

15 kb to 20 kb

5 μg

140 ng/μL

随着PacBio试剂的更新和欧易公司对测序系统的调试,建库指标可能会有不同程度的提升,上表仅作为一般参考标准。

包装过程中的注意事项

(1)    冷冻保存管表面,用油性记号笔标明样本编号及样本类型,并且不要与乙醇等有机溶剂接触;

(2)    不要用纱布、纸张直接包裹样本,而是用冷冻保存管包裹后再装入样本袋中;

(3)    不要把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内,因为纸张在液氮中是易碎的;

(4)    不要用玻璃容器在液氮中保存样本,样本包装中不要使用透明胶带;

(5)    标签纸应该贴于样本袋绳上,不要贴于容器表面以免脱落造成样本混乱;

(6)    不要在一只样本袋中放过多的样本,以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷;

(7)    客户在填写《样本登记单》时应当详细描述样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节,以便技术人员确定合理的实验方案。


样品运输

(1)    样品运输之前,请确保提取高品质、高分子量的DNA。我们建议采取干冰保存下的超低温运输,以尽量减少受热对DNA造成的影响。

(2)    在干冰装运之前,建议在样品中加入DNAstable® Plus(Biomatrica)防腐剂,以减少运输过程中的破裂,特别是在海外(或长途)运送的液体样品或者环境不受控制的情况。DNAstable Plus防腐剂不会影响SMRTbell™文库的制备。

(3)    如果DNA样品在管中运输,则应将其盖紧,以防止意外溢出或交叉污染。请在二级容纳物中装运DNA样品,以防止管子破裂。

(4)    只要能够确保密封,并放置于二次密封容器中,采用96孔板提交样品也是可以接受的。客户应确保每个孔的密封,避免意外泄漏或交叉污染。

(5)    在使用干冰装运之前,请先将二次密封容器置于-20℃冷冻处理。不要在没有二次容纳的情况下运输管或96孔板,因为直接放在干冰上时可能会破裂。

(6)    请检查样品四周置入干冰的量,我们鼓励干冰过量。如果一批样品含有多块板材,请确保板材之间有填料,以防止密封件穿孔。包装板紧贴,以尽量减少运输过程中的移动或推挤。

(7)    最后,在联系快递公司时,请确保提供了正确的联系方式和地址,寄件人信息也应完整填写。向接收方提供快递公司的跟踪号码和电话号码,以便跟踪延误或不当的交付。对于海外运输(或较远距离的运输),请安排您的货物在本周早些时候出发(例如星期一或星期二),以便在工作日到达。尽量减少周末包裹的运送,因为它们可能会落入无人值守的环境中。


机构简介

2009年,从基因芯片技术入手,本着为客户提供优质而有温度的高端技术服务这一简单想法,欧易开启了事业征程。九年来,沐风栉雨,初心不改,从文库技术到基因芯片技术、二代测序技术、三代测序技术、质谱技术,我们一直在高端组学技术领域开拓前行。通过技术开发、流程优化、精良设备引进、优秀人才聚集、持续管理提升,欧易建立起了行业一流的质量标准以及严格的质控体系,并始终秉承“硬数据,好服务”的一贯追求,为客户提供优质的高端技术服务。 欧易先后获得美国Agilent公司、美国Affymetrix公司、美国Pacbio公司在中国的认证服务商资质,先后与中国海洋大学、中科院遗传所等建立了紧密的产学研合作,与日立诊断公司共建联合研发实验室,并先后获得”上海市高新技术企业“、“浦东研发机构”、“专精特新企业”等政府资质。2017年,控股上海鹿明生物,实现了从基因组、转录组、表观组到蛋白组、代谢组的完整组学技术服务;成立晶准医药,实现了从科技服务到精准医疗的跨越,在多年技术积累的基础上,全力推进分子诊断产品的研究开发。成立以来,欧易已经服务客户近万名,用户单位过千家,协助客户发表SCI论文数千篇,积极参与并推动了科技服务产业的发展。 今天的欧易,以生物科技为核心,以科技服务、分子诊断为两大主攻方向,正昂首阔步迈向未来。 主要产品、仪器设备及特点 二代测序:最流行的基因测序技术,在科研、临检等生物医学应用里有着广泛的使用。 三代测序:最前沿的测序技术,具有长读长、高通量、高准确率等特点,为研究领域带来全新的测序体验。该技术能够实现单个DNA分子的测序,并且实时监控测序结果。 基因芯片:能快速得到基因表达谱的变化,广泛应用于生物学与医学的基础研究、疾病诊断、新药开发、环境保护等许多方面。 酵母文库:利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域。

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